广东茂名市监测HIV病毒复制方法

 在测定药物的活性前，需首先确定病毒株的感染性。用Spemamn-Karber建立的统计方法进行终点稀释分析。感染性滴度测定使用各种HIV-1易感的细胞系，包括来自正常人的经PHA刺激的PBMC。在确定病毒贮存液的感染性后，按照1 000 TCID50/1×10^6细胞的剂量接种病毒，加入不同浓度药物。在培养的第4天换掉50％的培养基，7 d后收集培养上清液监测是否有病毒复制及其复制的程度，计算药物对病毒的50％抑制浓度。实验需要设阳性药对照、阴性对照和空白对照。原则上需选用与待测药物作用靶位相同的药物作为阳性对照，AZT是最常用的阳性对照。

．培养上清液RT活性检测收集病毒培养上清液，测定RT的活性，从而确定化合物对病毒复制的抑制程度。以不加化合物的反应孔为对照，计算出使酶活性抑制达50％或90％时的化合物浓度，即EC50或EC90。同时检测该化合物对细胞产生50％细胞毒性时的浓度，即TC50，最后计算出该化合物的治疗指数(TI=TC50/EC50)，以判断其抗HIV的活性。主要操作步骤是：

30ul病毒培养的上清液加入30ul病毒裂解缓冲液(含50mmol/LTris，pH 7.8，0.15 mg／ml DTT，0.1％Triton X-100)

10ul的裂解后病毒样品

2 ul1 mol／L Tris，pH 7.8

1ul 3 mol／L KCl

5ul 3 mg/ml DTT

5ul 0.1 mol/L MgCl2 

10ul poly(rA).Oligo(dT)10(2 U/mll)

6.5ul H2O

0.5ul10％Triton X-100

10ul [3H]dITP(16.56 Ci/mmO1)

样品于37℃孵育30 min，收获到DE81离子交换纸，吸收15 min，然后用5％Na2HPO4冲洗6次，蒸馏水洗2次。干燥后以液闪计数器计数。

2.培养上清液HIV-1 P24测定通过测量一种药物抑制细胞感染病毒后产生P24抗原的程度判断药物对病毒抑制的效果。市售的HIV P24抗原检测试剂盒多采用酶免疫分析技术(enzymeimmunoassay，EIA或酶联免疫吸附技术(enzyme-linked immunoab-sorbant assay，ELISA)，在96孔板上进行P24核心蛋白的定性和定量检测。将鼠源P24抗原的单克隆抗体包被于96孔板，样品和裂解缓冲液加入各孔并孵育，如果存在HIV-1 P24抗原，将结合到各孔包被的单克隆抗体。接着加入HRP标记的P24抗原的抗体，结合于固相的抗原，抗体复合物。最后一步，加入包含，IMB(tetra-methylbenzidine)和过氧化氢(hydrogen peroxide)的底物，变成蓝色，加酸终止反应，测量其光吸收值。颜色的强度与P24抗原的量成正比，通过与已知的HIV-1 P24标准曲线比较确定样品的P24含量。

Virontika HIV-1 P24检测试剂盒在定量测量时，首先将阳性对照(含160 pg/ml的HIV-1 P24核心抗原)进行梯度系列稀释，制备5个连续的2倍稀释的阳性对照。用未感染的细胞培养液上清稀释，混匀之后再稀释下一梯度。所有阳性对照稀释液应平行做两份。计算每一阳性对照稀释液和所有未知样品吸收值的平均值。

(1)以阳性对照稀释液的信号和Cutoff的比值(signal/cutoff)或光吸收值的平均值为Y轴，相应的P24抗原的浓度为X轴，作定量校准曲线，从而计算各样品的浓度。

(2)通过标准曲线或用线性回归分析测定每一样品的HIV-1 P24抗原浓度，只有Signal/Cutoff在标准曲线范围内的样品，其浓度值才是可信的。

(3)如果某一样品的Signal/Cutoff超出标准曲线的范围，则将样品稀释后重测，稀释血清和血浆要用阴性对照，稀释细胞培养液用未感染的细胞培养上清液。

3.观察细胞病变(cytopathin effect，CPE)HIV-1体外感染某细胞系后，如MT-4、MT-2，会产生明显的细胞形态改变，特别是MT-2，HIV-1感染后产生大的合胞体细胞，并导致细胞死亡。将细胞接种于96孔板，每孔50ul，含细胞2.5×10^4个/ml。在不同的孔中分别加入各浓度受试药物50ul，然后每孔加100ul病毒(100 TCID50)。当病毒对照孔细胞病变为4个+时，记录细胞病变结果(细胞病变在25％以下为+，26％-50％病变为++。51％-75％病变为+++，76％～100％病变为++++，正常细胞为-)。7 d后NTr染色法测定细胞活性。

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